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Biologia das Comunicações volume 6, Número do artigo: 583 (2023) Citar este artigo

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A capacidade de visualizar a química celular em nanoescala é fundamental para entender a biologia celular, mas muitas microscopias ópticas são restritas pelo limite de difração de ~(200–250) nm. A microscopia eletrônica e as técnicas de fluorescência de super-resolução superam esse limite, mas contam com coloração e rotulagem especializada para gerar contraste de imagem. É um desafio, portanto, obter informações sobre a química funcional dos componentes intracelulares. Aqui demonstramos uma técnica para mapeamento químico intracelular livre de rótulos com resolução em nanoescala (~ 30 nm). Usamos um microscópio óptico baseado em sonda iluminado com um laser infravermelho médio cujos comprimentos de onda excitam modos vibracionais de grupos funcionais que ocorrem dentro de moléculas biológicas. Como demonstração, mapeamos quimicamente estruturas intracelulares em células de mieloma múltiplo humano e comparamos as morfologias com micrografias eletrônicas da mesma linha celular. Também demonstramos o mapeamento livre de marcadores em comprimentos de onda escolhidos para direcionar as assinaturas químicas de proteínas e ácidos nucléicos, de uma forma que pode ser usada para identificar marcadores bioquímicos no estudo de doenças e farmacologia.

A rota padrão para o conhecimento ultraestrutural, microscopia eletrônica (EM), usa amostras que são coradas com metais pesados ​​para gerar contraste de absorção de elétrons e condutividade elétrica. Eles geralmente são embutidos em resina para resistir ao bombardeio de elétrons no vácuo em um processo que leva vários dias. Além disso, na ausência de imunomarcação muito específica, as imagens EM fornecem apenas informações morfológicas e apenas revelam características ultraestruturais que levam a coloração.

Uma variedade de microscopias de fluorescência de super-resolução também permite imagens de subdifração de estruturas celulares1,2, mas todas exigem rótulos específicos para o problema em questão e geralmente dependem do conhecimento a priori das estruturas para uma rotulagem eficaz. Na prática, a fotobranqueamento dos fluoróforos, bem como problemas com estabilidade e especificidade, limita a precisão com que os rótulos podem ser localizados. Mesmo que tais desafios técnicos sejam superados, a capacidade de localizar estruturas é limitada pela distância entre a estrutura alvo e o fluoróforo, definida pelos comprimentos dos marcadores fluorescentes e moléculas de ligação usadas, que normalmente são vários nanômetros cada3. Crucialmente, também existe o risco de que a rotulagem perturbe a biologia das amostras1.

A espectroscopia de infravermelho (IR) e a geração de imagens são amplamente utilizadas para obter informações químicas quantitativas sem marcadores, mas o limite de difração geralmente as torna incapazes de gerar imagens no nível intracelular. Para superar esse limite, várias técnicas de imagem baseadas em sondas foram desenvolvidas, combinando o poder de resolução em nanoescala da microscopia de força atômica (AFM) com a sensibilidade química da espectroscopia de infravermelho4,5. Usamos microscopia óptica de campo próximo de varredura do tipo dispersão (s-SNOM), onde a sonda AFM é iluminada por um laser IR sintonizável. Coletar e analisar a luz infravermelha retroespalhada da pequena região onde a ponta e a amostra interagem nos permite inferir as propriedades de absorção de infravermelho do material da amostra naquela região. O ajuste do laser nos permite obter imagens com especificidade química sem a necessidade de coloração ou rotulagem. É importante ressaltar que imaginamos o próprio material biológico. Detectamos características ultraestruturais que nunca antes foram visualizadas diretamente com luz, aumentando a possibilidade de encontrar novas estruturas intracelulares que não aparecem no EM.

O s-SNOM foi previamente empregado para imagens de espécimes biológicos isolados, como complexos de proteínas6,7,8, vírus9 e fibrilas amiloides10, bem como imagens de superfície de células inteiras11,12,13. Estruturas intracelulares em células e tecidos também foram visualizadas em organismos unicelulares14 e tecido retiniano de peixe-zebra15, respectivamente. Aqui nós desenvolvemos isso mapeando quimicamente estruturas intracelulares em células de mieloma múltiplo humano, incluindo, para conhecimento dos autores, as primeiras imagens de subdifração diretamente ópticas do retículo endoplasmático (ER), mitocôndrias (Mt) e componentes fibrilares nos nucléolos. Ao variar o comprimento de onda da iluminação para atingir diferentes grupos químicos nas células, também demonstramos o isolamento da ultraestrutura de uma forma que tradicionalmente só é alcançada com rotulagem altamente específica.